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毕赤酵母高效表达热稳定性褐藻胶裂解酶及其在生产褐藻寡糖的应用

时间:2022-08-04 00:22
本文摘要:01文章背景概述BACKGROUNDINTRODUCTION褐藻胶是由β-D-太和糖醛酸(M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)通过α/β-1,4糖苷键随机排序而出的一种酸性多糖,这两种糖单元互相单体构成三种有所不同的结构单元:凝太和糖醛酸(PolyM)、凝古罗糖醛酸(PolyG)及M和G随机人组构成的杂聚物(PolyMG)。

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01文章背景概述BACKGROUNDINTRODUCTION褐藻胶是由β-D-太和糖醛酸(M)及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)通过α/β-1,4糖苷键随机排序而出的一种酸性多糖,这两种糖单元互相单体构成三种有所不同的结构单元:凝太和糖醛酸(PolyM)、凝古罗糖醛酸(PolyG)及M和G随机人组构成的杂聚物(PolyMG)。褐藻胶降解酶普遍不存在于生长在海水、土壤和海洋藻类的微生物中,以弧菌、假单胞菌、固氮菌、芽孢杆菌、朱杆菌等海洋细菌尤为少见,在少数真菌和病毒中也有褐藻胶降解酶的不存在。褐藻胶降解酶是一种专性降解褐藻胶的多糖水解酶,可通过β避免反应截断酸性褐藻胶多糖糖苷键,并在新的分解的非还原成末端C4,5间产生具备不饱和双键结构的寡糖产物。

褐藻胶降解酶按其对底物水解方式的有所不同分成核苷酸α-L-1,4-古罗糖醛酸降解酶、核苷酸β-D-1,4-太和糖醛酸降解酶及两种片段都能降解的双功能降解酶。褐藻胶的水解产物褐藻寡糖在医药、农业、食品等领域都具备极大的利用潜力,有研究指出其在抗氧化、抗肿瘤、抗凝血、抗真菌、神经维护、肠道消化吸收及植物的生长及保鲜等方面展现出出有较好的生物活性。

毕赤酵母传达系统具备细胞外蛋白黏液能力强劲、分离出来便利、无内毒素分解等优点。该系统一般来说是工业生产重组蛋白的选用,但目前还没褐藻胶降解酶在毕赤酵母系统中重组传达的报导。

对毕赤酵母在褐藻胶降解酶生产中的潜在应用于展开研究具备很好的研究价值。2018年,杭州师范大学的HaifengLi等人在《MarineDrugs》(IF2018=4.379,医学2区)公开发表了为题“High-LevelExpressionofaThermallyStableAlginateLyaseUsingPichiapastoris,CharacterizationandApplicationinProducingBrownAlginateOligosaccharide”的文章。

在本研究中,对黄杆菌H63的褐藻酸降解酶基因sagl在毕赤酵母中顺利展开了传达,并取得了较高的产量。在此之前,由于涵括体问题,sagl基因在大肠杆菌中并没获得很好的传达。

同时,该研究对酵母生产的重组海藻酸降解酶的特性展开了详尽的研究。此外,利用该重组酶对褐藻酸寡糖的大规模生产展开了研究。02所用到的主要方法METHODS1.大肠杆菌和毕赤酵母重组传达;2.SDS-PAGE;3.Westernblot;4.去糖基化;5.TLC薄层色谱;6.ESI-MS;7.氨基酸系统发育树根建构与分析03文章主要内容摘要ABSTRACT本文将源于黄曲霉H63的褐藻胶降解酶基因sagl在密码子优化后在毕赤酵母中通过高密度烘烤构建低传达,在酵母培育上清中sagl(rSAGL)重组酶的最低产量超过226.4μg/mL(915.5U/mL)。

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这是迄今为止海藻酸钠降解酶重组传达的最低产量。rSAGL通过EndoH消化证实为部分糖基化蛋白。该酶的最佳反应温度为45°C、必要条件pH为7.5;在80mMK+浓度下最少可使酶的催化活性提升244%。

rSAGL是一种热平稳酶,T5015为57~58°C,T5030为53~54°C,其热稳定性高于任何未知的海藻酸钠降解酶。在pH为6的100mM磷酸盐缓冲液中,rSAGL在50°C孵育2h后可保有98.8%的初始活性,在某种程度温度48h后仍可保有初始活性的61.6%。

通过毕赤酵母生产提纯后的rSAGL的特异活性可超过4044U/mg,这是迄今为止海藻酸钠降解酶的第二低记录。当rSAGL细酶必要用作转化成40g/L的海藻酸钠,在50℃培育32小时后,可以将97.2%的底物转化成二、三、四糖。混合物中还原成糖的最后浓度超过9.51g/L。

这是首次利用毕赤酵母系统低传达热平稳的褐藻胶降解酶。


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